Tipps & Tricks

Was ist schnelle Chromatographie?

In einer Zeit, in der Produktivität so hoch gehandelt wird, wie niemals vorher, ist natürlich auch eine schnelle Analytik gefragt. Was heißt aber schnelle Analytik? Wie schnell muss schnelle Analytik denn sein?

Betrachten wir das doch einmal am Beispiel der Chromatographie.

Jeder wird der Meinung sein, dass schnelle Chromatographie nicht zu Lasten der Richtigkeit der Analysen gehen darf und so preiswert wie möglich sein sollte. Aber schon dann gibt es viele verschiedene Antworten auf die Forderung nach schneller, richtiger und preiswerter chromatographischer Trennung.

Als erstes stellt sich die Frage nach der geforderten Auflösung, d.h. wie viel Substanzen müssen getrennt werden. Bei einer sehr großen Anzahl von zu trennenden Peaks ist sicherlich die Gaschromatographie die Methode der Wahl, denn die Kapillargaschromatographie erlaubt durch hohe Trennstufenzahlen der Säulen die Auftrennung einer Vielzahl von Peaks. Allerdings sollten die Substanzen unzersetzt flüchtig sein, was natürlich eine deutliche Limitation sein kann.

Eine alternative, speziell bei geladenen Teilchen, ist hier die Kapillarelektrophorese. Aber schon hier kommt das Problem der Probenvorbereitung zum Tragen. In der CZE sowie bei den HPLC-Methoden ist eine gute Probenvorbereitung häufig unerlässlich. Das bedeutet aber auch, dass bei CZE sowie UPLC oder UHPLC die Trennung nicht schneller zu sein braucht, als die Probenvorbereitung. Nun hat sich in den letzten Jahren immer mehr ein Trend zu on-line Probenvorbereitung durchgesetzt, der aber bei den Kapillarmethoden nur schwer zu verifizieren ist. Die UPLC, UHPLC, CZE und ähnliche Methoden sind also im Wesentlichen bei Trennungen gefragt, die ohne Probenvorbereitung auskommen können; und selbst dann braucht die Trennung nicht schneller sein, als der Autosampler injizieren kann!

Benötigt man aber eine Probenvorbereitung ist nach wie vor die klassische HPLC mit max 3mm ID Säulen die Methode der Wahl, da man mit konventionellen, nicht speziell optimierten Geräten mit all den Optimierungsproblemen , die in der Praxis auftauchen, arbeiten kann. Schnell und preiswert heißt hier nun, dass das Gerät preiswert sein sollte und man sorgfältig prüfen muss, in wieweit die Software unbedingt alle FDA-Anforderungen erfüllen muss, denn es gibt ja auch außerhalb der pharmazeutischen Analytik genügend Probleme, die mit einer einfacheren, dafür aber deutlich preiswerteren Software bearbeitet werden können. In jedem Fall sollte man aber versuchen, die Trennung isokratisch zu optimieren, da hier das größte Zeitersparnispotential liegt, nicht zuletzt auch wegen der Rekonditionierungszeit Außerdem kann man durch Einsatz von Solventrecyclern die Elutionsmittelkosten deutlich senken. Moderne Säulenkopplungstechniken wie z.B. die POPLC ermöglichen isokratische Trennungen, wo es vorher nur Lösungen mittels Gradienten gab, da man praktisch den Gradienten weg vom Eluenten hin zu der Säule transferiert.

Letztendlich gibt es aber auch chromatographische Methoden, die in vielen Fällen ohne Probenvorbereitung auskommen. Hier ist zunächst einmal eine fast vergessenen „elekrochromatographische „ Methode, die Isotachophorese (ITP) zu nennen, bei der es durchaus möglich ist, Ketchup oder Senf direkt zu injizieren und trotzdem eine zuverlässige Bestimmung diverser Ionen zu erhalten.

Last not least haben wir mit der Dünnschichtchromatographie eine Methode zur Hand, bei der man weit mehr als 10 Proben parallel in weniger als 15 Minuten trennen kann, ausreichend genau quantifizieren kann und auch hier keinerlei Probenvorbereitung benötigt, da man die Platte eben nur einmal benutzt, dokumentiert und verwirft. Moderne DC-Techniken erlauben heutzutage selbst die Kopplung mit der MS.

Man sieht also, dass es viel Kriterien gibt, die zu bedenken sind, bevor man sich für scheinbar moderne Methoden entscheidet, die in jedem Fall teuer, aber nicht immer die optimale Problemlösung sein müssen.

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Überprüfung der Peakreinheit

Problemstellung:

Eine unbekannte Probe wird analysiert und es soll ein Fingerprint per HPLC geschaffen werden, um für gleichmäßige Qualität zu sorgen.

Frage:

Wie kann ich sicher sein, dass die Peaks „sauber“ sind?

Antwort:

Auf die Frage kann man schlicht und einfach antworten, dass man bei unbekannten Proben nie ganz sicher sein kann, ob ein auftauchender Peak wirklich nur einer Substanz zuzuordnen ist. (vgl. auch hier Tipps und Tricks 5-2007 Peakidentifikation)

Allerdings kann man mit einer Reihe von Maßnahmen die Wahrscheinlichkeit der Reinheit eines Peaks signifikant erhöhen. Bewusst soll an dieser Stelle nicht auf die aufwendigen modernen Kopplungstechniken wie HPLC-MS oder HPLC-NMR eingegangen werden, da hier erheblicher apparativer Aufwand nötig ist.

Als erstes muss sichergestellt werden, dass überhaupt alle vorkommenden relevanten Substanzen unter den angewendeten chromatographischen Bedingungen gesehen werden können. Hier stellt sich die Frage nach der Detektionswellenlänge, da ja bekanntlich in der sehr verbreiteten UV-Detektion selektiv, also wellenlängenabhängig, detektiert wird. Am einfachsten ist hier eine Injektion bei einer anderen Wellenlänge. Hat man z.B. die beliebten 254 nm bei dem ersten Injekt gewählt, so sollte man nun möglichst kurzwellig arbeiten, also bei z.B. 210 nm, wenn es der „UV cut off“ des Elutionsmittels erlaubt, da man im Allgemeinen im kurzwelligen Bereich universeller detektieren kann. Bei Einsatz eines Diodenarraydetektors liegen natürlich alle Informationen gleichzeitig an, so dass auf eine zusätzliche Injektion verzichtet werden kann.

Selbst wenn nun die Chromatogramme identisch sind, ist das noch kein Beweis, dass die Peaks wirklich rein sind, denn aliphatische Substanzen wie z.B. Zucker oder viele Aminosäuren sieht man auch jetzt noch nicht. Hier sollte man, isokratische Trennung vorausgesetzt, einmal den Einsatz eines anderen Detektors, z.B. RI- (oder Brechungsindex-) Detektor erwägen. Dieser Detektor ist viel universeller, allerdings weniger empfindlich und nicht gradiententauglich. Ist Gradientenelution erforderlich, so bietet sich der Einsatz eines ELSD (Lichtstreudetektor) an.

Zusätzliche Sicherheit gewinnt man bei Trennung in einem anderen chromatographischen System. Dabei kann die Säule beibehalten werden und der Eluent geändert werden, also bei gepufferten Systemen z.B. einen anderer Puffer, ja sogar ein anderer pH gewählt werden oder statt Methanol/Wasser Acetonitril/Wasser und und umgekehrt eingesetzt werden.

Natürlich ist es auch möglich, die Säule auszutauschen und z.B. eine RP 18 – Phase gegen eine RP 8 – Phase oder sogar eine CN – Phase auszutauschen.

Selbst der Einsatz des gleichen Säulentyps mit einer kleineren Korngröße, also 3µ statt 5µ kann zusätzliche Erkenntnisse bringen.

Fazit:

Durch Änderung von chromatographischen Parametern erhält man zusätzliche Erkenntnisse über die Peakreinheit. Es ist sehr unwahrscheinlich, dass die Trennung unterschiedlicher Substanzen in verschiedenen chromatographischen Systemen das gleiche Ergebnis bringt. Unterschiedliche Chromatogramme weisen auf unvollständige Trennungen hin.

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Troubleshooting III – Das Injektionssystem

Problemstellung:

Das Chromatogramm zeigt breite Peaks und/oder die quantitative Auswertung ist nicht reproduzierbar

Frage:

Was kann die Ursache für diese Problematik sein?

Antwort:

Wie schon verschiedentlich an dieser Stelle angesprochen wurde, ist die Minimierung von Totvolumina ein zentrales Thema in der HPLC und noch mehr in der UHPLC. Dabei ist, vor allem bei isokratischen Trennungen, das Totvolumen zwischen Injektion und Säule kritisch. Häufig wird hier auch mit extrem dünnen und kurzen Kapillaren gearbeitet; trotzdem wird in manchen Fällen das gewünschte Ergebnis nicht erreicht.

Dies ist meistens der Fall, wenn mit einem automatischen Probengeber gearbeitet wird. Der Autosampler wird in vielen Fällen neben dem „Basisgerät“ platziert und benötigt so längere Kapillaren, um mit Pumpe einerseits und der Säule andererseits verbunden zu sein. Je kleiner der Innendurchmesser der Säule ist, desto geringer muss nun auch das Totvolumen an dieser Stelle sein. Das führt z.B. bei UPLC und UHPLC häufig zu Schwierigkeiten, da Kapillaren mit kleinen Innendurchmessern nun einmal auch anfälliger für Verstopfungen sind.

Was jedoch häufig nicht berücksichtigt wird, ist der Fakt, dass ja auch der Autosampler ein nicht unerhebliches konstruktionsbedingtes internes Totvolumen hat, das unbedingt bei der Betrachtung berücksichtigt werden muss.

Speziell bei der quantitativen Bestimmung kommt dem Probengeber eine zentrale Bedeutung zu und er kann daher auch eine zentrale Fehlerquelle sein. Einfache Probengeber, die in jedem Fall mit „full loop“ arbeiten, also eine eingebaute Schleife vollständig füllen und dann dies gesamte Volumen injizieren sind relativ störungsunanfällig. Daher hat sich in der HPLC (im Gegensatz zu der GC) das Arbeiten mit einem externen Standard weitestgehend durchgesetzt.

Es ist aber leicht vorstellbar, dass schon das Ansaugen einer kleinen Luftblase das Injektionsvolumen (in der konventionellen HPLC häufig 20 µl) zu größeren Ungenauigkeiten führt, zumal bei Mehrfachinjektionen die Luftblase nicht immer auftreten muss und schon gar nicht reproduzierbar ist.

Schon beim Ansaugen der Probe kann es (speziell bei Niedrigsiedern) zu Luftblasenbildung kommen, was man häufig aber im Glaskolben der Spritze beobachten kann. Hier muss dann in jedem Fall diese Luft entfernt werden. Dazu kann man die druckseitige Kapillare meistens lösen und ohne Gegendruck des Systems den Kolben luftfrei machen. Hier sollte unbedingt das entsprechende Manual zu Rate gezogen werden.

Wenn vermutet wird, dass auf Grund von Injektion verschiedener Volumina das quantitative Ergebnis nicht zweifelsfrei ist, so empfiehlt sich die Verwendung eines internen Standards. Diese Technik ist auch bei der manuellen Injektion häufig anzuraten, da ja neben der oben diskutierten Möglichkeit der Luftblasen ja auch noch die Reproduzierbarkeit des angesaugten Volumens in der Spritze individuell variiert

Beim internen Standard mischt man der Probe eine bekannte Menge einer nicht störenden Substanz zu und bezieht diese in die quantitative Auswertung mit ein, so dass der „Spritzenfehler“ eliminiert wird.

Fazit:

Das Injektionssystem (manuell oder automatisch) hat grossen Einfluss auf die Trennung und sollte von Zeit zu Zeit akribisch zumindest auf Luftblasen und Totvolumina überprüft werden.

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Problemstellung:

Trotz aller Sorgfalt erhalte ich keine ruhige Basislinie im Chromatogramm oder gar kein Signal

Frage:

Was kann ich tun, um mit „Bordmitteln“ zu analysieren, was das Problem ist

Antwort:

Jeder Anwender in der HPLC hat es schon erlebt: entweder ich erhalte eine sehr unruhige Basislinie oder manchmal sogar eine viel zu ruhige Basislinie.

Der zweite Punkt klingt sehr trivial und ist es letztendlich auch. Hier gilt es in jedem Fall, erst einmal sicher zu stellen, dass alle Kabel fest angeschlossen sind und sich nicht gelöst haben. Bei modernen Geräten wird es in den meisten Fällen eine PC-Verbindung, häufig RS232C sein. Bei älteren Systemen oder Systemen in die Detektoren verschiedener Hersteller integriert wurden, erfolgt die Datenübertragung häufig noch analog, so dass der entsprechende Anschluss am Detektorausgang und der am A/D – Wandler Eingang überprüft werden muss. Ist hier alles in Ordnung sollte jetzt überprüft werden, ob die Detektorlampe brennt.

Ist die Detektorlampe gar nicht an, ist die Basislinie natürlich extrem ruhig; es kommt allerdings auch kein brauchbares Signal an. Also muss in den meisten Fällen die Detektorlampe ausgetauscht werden.

Eine unruhige Basislinie kann auch durch die Detektorlampe verursacht werden, gerade wenn man die Lampe frisch ausgetauscht hat, diese auch zündet und man glaubt, alles Erdenkliche getan zu haben. Bis eine Detektorlampe aber gleichmäßig brennt, muss sie „eingebrannt“ sein, dass heißt, schon eine gewisse Zeit, z.B. über Nacht gebrannt haben.

Eine UV-Lampe hat heutzutage eine Lebensdauer von mindestens 1000 Stunden, longlife-Lampen sogar eine merklich höhere. Zum Ende der Lebensdauer der Lampe wird dann die Lampenenergie geringer und die Empfindlichkeit lässt nach. In vielen Geräten lässt sich die Lampenenergie und/oder die Lampenbrennzeit im GLP-Modus abfragen und viele Lampen haben einen eingebauten Stundenzähler.

Ist auf dieser Seite des Detektors alles in Ordnung, gilt es zu überprüfen, ob die Durchflusszelle in Ordnung ist. Häufig befindet sich eine kleine Luftblase in der zelle, die nun durch den Fluss nicht hinaus befördert wird, sondern auf Grund der Zellgeometrie sich vor dem Fenster hin und her bewegt. Hier hilft es, kurzzeitig etwas gegendruck hinter der zelle zu machen, aber Vorsicht, bei zu hohem Druck kann die Zelle platzen. Wenn möglich sollte also ein Rückdruckregler eingesetzt werden. Weiterhin kann aber auch die kapillare am Ein- oder Ausgang leicht verschmutzt oder sogar verstopft sein. Das kann ganz leicht überprüft werden: Wenn die Kapillare abgeschraubt wird, darf sich der Systemdruck nicht merklich verändern.

Zu guter letzt kann natürlich auch die Zelle selbst verschmutz sein, d.h. es kann sich ein Belag auf dem Küvettenfenster gebildet haben, der nun Streulicht verursacht. Zur Reinigung der Zelle ist hier auf die Empfehlung des jeweiligen Herstellers zu achten, denn es gibt Küvetten, die man ohne Weiteres auseinander nehmen kann um dann die Fenster zu reinigen. In manchen Fällen kann auch mit oxidierenden Säuren gereinigt werden. In jedem Fall kann man aber versuchen, die komplette Küvette im Ultraschallbad zu reinigen.

Fazit:

Bei unruhiger oder zu ruhiger Basislinie, die nicht auf die Säule zurückzuführen ist, ist in jedem Fall zunächst der Detektor zu überprüfen

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Passivierung

Der Fall

Passivieren mit 6 N HNO3 ist ein altes, bewährtes Mittel, um 1. die Anlage gründlich zu reinigen und 2. die Oberfläche von Stahl (Pumpe, Kapillaren etc. ) zu passivieren - also praktisch inert zu machen. Ich höre jedoch bei Seminaren oder vor Ort häufiger Klagen, wie:

"Nachher hat nichts mehr funktioniert, wir mußten sämtliche Dichtungen auswechseln"

"Das Neutralspülen hat 3 Tage gedauert"

"Wir hatten nach der Behandlung mit der Salpetersäure jede Menge Geisterpeaks gehabt" und vieles dergleichen.

Das ist alles richtig und diese Probleme treten tatsächlich auf, wenn bestimmte Sachen nicht beachtet werden. Was wäre das?

Die Lösung

Es folgen Tipps, Empfehlungen und Vorsichtsmassnahmen, um erwähnte Probleme zu vermeiden oder wenigstens zu minimieren.

  • Manche(r) Anwender(in) hat ein komisches Gefühl, eine so starke Säure einzusetzen, man verwendet also eine 10 oder 20%ige HNO3. Das allerdings ist "tödlich": Erstens kann die Passivierung einer Stahloberfläche nur mit einer 6 N HNO3 erfolgen und zweitens - viel wichtiger! - bei verdünnteren Säurekonzentrationen können Nitroso-Gase entstehen. Diese braune Dämpfe können Dichtungen zerstören, führen zu Geisterpeaks und es kann sehr lange dauern, bis sie die Anlage verlassen. Also: Entweder Sie sollten eine 6 N HNO3 verwenden oder wenn Sie sich nicht trauen, sollten Sie lieber das Ganze sein lassen.
  • Tipps zum Neutralspülen
    1. Selbstverständlich können Sie die UV-Detektorzelle mitspülen. Weil sich aber dort sehr enge Kapillaren/Kanülen befinden, dauert das Neutralspülen recht lange. Entweder Sie müssen sich damit abfinden oder aber - falls die UV-Zelle eine Reinigung nicht nötig hat - Sie umgehen den Detektor und gehen mit der Kapillare direkt zum Abfallgefäß.
    2. Die Zeit zum Neutralspülen kann enorm gekürzt werden, wenn Sie nach der Behandlung mit der Salpetersäure und vor dem Neutralspülen mit dem Wasser eine Zwischenspülung mit wasserfreier Essigsäure (Eisessig) einlegen.
    3. Beim Neutralspülen sollte das Wasser am Anfang 2-3 mal nach kurzen Zeitabständen ausgewechselt werden, also legen Sie zuerst eine Art "Vorspülgang" ein, bevor Sie mit dem richtigen Neutralspülen beginnen, denn: Durch die Rückdiffusion der Säure aus dem Verbindungsschlauch zur Pumpe bzw. aus der Ansaugfritte hätten Sie sonst immer wieder Säure in Ihrem Reservoir und Sie würden statt mit Wasser eben mit "saurem" Wasser spülen (Hinweis: Daniel Stauffer, Hoffmann La Roche, Basel).
  • Wenn Sie sich für das Passivieren entscheiden, so tun Sie es bitte mindestens 1-2 mal im Jahr. Wenn Sie nämlich alle 2-3 Jahre an diese Massnahme denken und sie dann auch durchführen, müßten Sie mit folgenden Schwierigkeiten rechnen: Nach einer längeren Zeit kommt so viel "Dreck" und Rost aus der Anlage herunter, dass Kapillaren verstopft werden können, Dichtungen "ihre" auskristallisierte Salze (die sie mit der Stahloberfläche innigst verbanden) verlieren und dadurch unbrauchbar werden, usw. Also bitte, wenn passivieren, dann doch relativ regelmäßig. Aber auch in diesem Fall sollten Sie in "worst case" damit rechnen, dass Sie nach dieser Prozedur die eine oder andere Kapillare bzw. Dichtung doch auswechseln müssten.

Das Fazit

Viele Anwender - und ich persönlich - haben gute Erfahrungen mit dem Passivieren gemacht, man sollte allerdings an bestimmte Dinge denken. Wenn Ihnen das ganze jedoch zu viel ist, dann lassen Sie das Passivieren Passivieren sein und spülen Ihre Anlage einfach mit heißem Wasser/Essigsäure und Isopropanol.

Edelstahl

  • Der in der HPLC verwendete Stahl zum Bau von Pumpenköpfen etc. trägt die Bezeichung 1.4571 und ist ein hochlegierter Titan-Stahl, der gegen fast alle Eluenten beständig ist, mit Ausnahme von halogenierten Säuren. Salzsäure korrodiert diesen Stahl sehr schnell, dagegen können Sie ohne Bedenken 25%ige Salpetersäure pumpen. Unsere Kapillaren bestehen aus der Stahlsorte 1.4401, die eine ählich gute chemische Beständigkeit hat. Die Edelstahlkapillaren sind noch bei einem Druck von über 1000 bar stabil.
  • Bei einer guten HPLC-Anlage bestehen alle Edelstahlteile aus sehr hochwertigen Stählen. Werden minderwertige Stähle für einige Teile verwendet, korrodieren diese, meist an Roststellen erkennbar.
  • Kapillaren: Diese sind normalerweise nahtlos, billige Produkte sind längsgeschweißt und reißen bei hohen Drücken. TECHLAB verwendet nur beste Qualitäten, diese können problemlos bis 1.000 bar belastet werden. Das bedingt allerdings, dass einmal aufgepresste Schneidringe nicht mehr entfernt werden können.
  • Fittinge: 1.4571 ist nicht sehr hart, aber sehr zäh und schwer zu spannen. Da Fittingschrauben keinen direkten Eluentenkontakt haben, kann hier eine andere, härtere Legierung verwendet werden, damit die Schraubenköpfe nicht so schnell abdrehen. Alle Gewinde sind zöllig.
  • Passivierung: Für spezielle Anwendungen kann es nützlich sein, alle Leitungen vor der ersten Verwendung zu passivieren. Pumpen Sie 25%ige Salpetersäure für einige Stunden durch das System (ohne Säule). Dabei werden die freistehenden Eisenatome sozusagen "weggefressen" und Störungen z.B. bei der elektrochemischen Detektion minimiert.
  • Reinigen: Pumpen Sie 25%ige Salpetersäure für einige Stunden durch das System ohne Säule, danach Wasser. Achten Sie vor Beginn auf eventuelle Lecks. TECHLAB-Pumpen sind garantiert salpetersäurefest, bei Fremdprodukten können wir allerdings keine Garantie übernehmen.
  • Schneiden Sie Edelstahl nur mit Spezialzangen oder sogenannten Tube-Cuttern.
  • Sägen oder feilen Sie niemals Stahl-Kapillaren. Winzigste Späne gelangen in den Injektor und ruinieren diesen sofort. TECHLAB liefert elektronenstrahlerodierte Kapillaren mit absolut glatten Enden.

Titan

wird nur noch vereinzelt verwendet, es ist relativ teuer, weil problematisch in der spangebenden Bearbeitung. Die Beständigkeit ist allerdings exzellent. Setzen Sie Titan dort ein, wo weder Edelstahl noch PEEK zu gebrauchen sind.

PEEK

PEEK (PolyEtherEtherKeton) ist auch als Victrex® (ICI) und Hostatec® (Hoechst) bekannt. Weitere Informationen und technische Daten erhalten Sie auf der Website von Victrex. PEEK ist auch bei Temperaturen von 250°C gut mechanisch belastbar.

PEEK ist ein sehr haltbarer und beständiger Kunststoff. Verwenden Sie diesen

  • bei Analysen, die von Edelstahl katalytisch zersetzt werden (biologische Materialien)
  • bei absolut metallfreien Systemen (alle Teile müssen dann aus PEEK sein, z.B. bei der elektrochemischen Detektion)
  • bei chlorierten Eluenten (diese können Edelstahl angreifen).
  • anstelle von PTFE, wenn es auf möglichst geringe Sauerstoffdurchlässigkeit ankommt.

Bitte beachten Sie, dass mit einigen Eluenten oder Proben Wechselwirkungen auftreten können, besonders dann, wenn diese länger in der PEEK-Probenschleife des Injektors verweilen.

Verwenden Sie PEEK nicht:

  • bei stark alkalischen Eluenten
  • bei Drücken über 250 bar
  • bei Temperaturen über 300°C (Schmelzpunkt ca. 350°C)

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Welche Bedeutung hat der Standard?

Die quantitative Bestimmung ist chromatographisch reproduzierbar, das Ergebnis wird aber vom Auftraggeber angezweifelt

Was ist hier die Ursache für diese Diskrepanz?

Die HPLC ist eine Methode, die zunächst einmal allein nicht zur Peakidentifizierung geeignet ist. Sie ist jedoch zur quantitativen Bestimmung von nichtflüchtigen Substanzen hervorragend geeignet. Diese quantitative Bestimmung erfordert aber, dass man die zu bestimmende Substanz kennt und sie zudem auch noch zur Verfügung steht. Man benötigt diese Reinsubstanz als Standard, der zur Kalibrierung (Eichung) eingesetzt wird. Da man im Allgemeinen mit einer Schleifeninjektion, sehr häufig in der Routine zudem „full loop“ arbeitet, ist der Einsatz eines internen Standards in der Regel nicht nötig.

Man injiziert dann eben eine Lösung bekannter Konzentration dieses Standards, erhält einen Peak mit einer definierten Fläche zu einer bestimmten Retentionszeit und setzt diese Fläche des Peaks mit der Fläche des entsprechenden Peaks in der Probe in Relation.

Das klingt zunächst einmal sehr einfach und ist es auch in der Vielzahl der Fälle. Schwieriger gestaltet sich die Analytik zum Beispiel beim Einsatz von Naturstoffen. Häufig steht dann nämlich kein oder zumindest kein reiner Standard zur Verfügung. Zu einer objektiven quantitativen Bestimmung ist jedoch der Einsatz eines Standards mit definierter Konzentration unerlässlich. Das kann durchaus heißen, dass man den Standard zunächst einmal auf Reinheit untersuchen (Ist es wirklich nur ein Peak, liegt möglicherweise ein Isomerengemisch oder ein Racemat vor etc.) und ggf mit anderen analytischen Methoden (z.B. Titration) der Gehalt bestimmt werden muss. Manchmal ist es sogar erforderlich, den Standard mit präparativer Chromatographie vorher rein zu gewinnen.

Das chromatographische Ergebnis kann nie besser sein als die Qualität des Standards. Häufig

sind Standards, auch als Gemisch in gewünschter Konzentration, gelöst und oft sogar zertifiziert, kommerziell erhältlich und das Problem ist elegant gelöst.

Häufig ist es aber auch der Fall, dass die Produktion ein technisches Gemisch zudotiert und von der betriebsüberwachenden Analytik wissen möchte, ob die Dosierung stimmt. Ein solches Gemisch kann nun aussehen wie in nebenstehendem Chromatogramm.

Hier bestehen prinzipiell mindestens zwei Möglichkeiten der Eichung:

    Man fasst die Flächen aller drei Peaks zusammen und korreliert die Einwaage mit der Summe der Flächen. Vorausgesetzt man benutzt einen photometrischen Detektor, ist das natürlich dann korrekt, wenn alle drei Substanzen den gleichen molaren Extinktionskoeffizienten haben.

    Man benutzt nur einen Peak (normalerweise den größten) zur Eichung.

Man wird in jedem Fall richtige Ergebnisse erhalten, solange man exakt die gleiche Substanz einsetzt, die auch in der Produktion verwendet wird. Treten jedoch schon kleine Änderungen auf wie z.B. ein Chargen-(Partie-) Wechsel, muss unbedingt darauf geachtet werden, dass entweder die Chargen (Partien) identisch sind, oder man muss mit Hilfe von Korrekturfaktoren dafür sorgen, dass die Ergebnisse vergleichbar bleiben.

Nur mit einem definierten Standard ist ei zuverlässiges quantitatives Ergebnis erzielbar. Entweder man kann die Standards kommerziell erwerben oder man muss sie selber qualifizieren.

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Wie kann man die Güte der Säule überprüfen

Die Trennleistung meines HPLC-Systems lässt nach und gerade bei sensiblen Problemen ist eine akzeptable Trennung nicht mehr gewährleistet.

Wie kann man der Ursache auf die Spur kommen?

Sehr häufig hat man eine Trennung erfolgreich ausgearbeitet, auch einige Zeit in der Routine damit gearbeitet und irgendwann, meistens nach dem eine Zeit lang mit einer anderen Säule gearbeitet wurde, ist die Trennung deutlich schlechter, man bekommt Tailing oder sogar Doppelpeaks, wo vorher nur ein symmetrischer Peak war.

Um zu diagnostizieren, ob das Problem wirklich im Bereich der analytischen Säule liegt, empfiehlt es sich, das bei der Anschaffung mitgelieferte Testchromatogramm nachzufahren. Bei fast allen Herstellern liegt solch ein Chromatogramm bei, in dem auch die chromatographischen Bedingungen und einige Kenngrößen ausgewiesen sind.

Wichtig ist nun, ein Chromatogramm unter genau den gleichen Konditionen zu fahren und mit dem Testchromatogramm zu vergleichen. Sind die Daten annähernd identisch, d.h. eine maximale Abweichung von 10% bei der Trennstufenzahl oder der Symmetrie, so muß das Problem wo anders gesucht werden. Bitte beachten Sie, dass das alleinige Bestimmen der Trennstufenzahl gänzlich ohne Aussage ist, da die Trennstufenzahl von den chromatographischen Bedingungen abhängig ist und sich die Hersteller bis zum heutigen Tag auf kein einheitliches Testsystem geeinigt haben.

Weicht das Ergebnis des Chromatogramms dramatisch vom Testchromatogramm ab, so ist zu überlegen, ob die Säule zu Beginn dieser Trennung wirklich gut äquilibriert war.

In der Normalphasenchromatographie ist dabei zu beachten, dass schon ganz kleine Wasseranteile auf der Säule zu wesentlich anderen Trennergebnissen führen können. Dabei ist speziell bei hydrophoben (unpolaren) Eluenten auch der Wasseranteil im Solvent zu überprüfen.

In der RP-Chromatographie sollte auf alle Fälle überlegt werden, ob die Säule zwischenzeitlich in anderen chromatographischen Modi, wie Ionenpaarchromatographie eingesetzt wurde, da das die Oberflächeneigenschaften stark verändert haben kann.

Ein häufiger Grund der Veränderung der Trennleistung ist das Austrocknen der RP-Säule während der Lagerung. Normalerweise sollte die Säule bekanntlich unter Methanol o.ä. gelagert sein, doch es kommt immer wieder vor, dass es zum Austrocknen kommt. Dann ist beim Wiedereinsatz unbedingt darauf zu achten, dass nun nicht direkt mit hohen Wassergehalten „konditioniert“ wird, da die (hydrohoben) Bürsten nun an dem Säulengerüst anliegen und praktisch keine Wechselwirkung mit der wässrigen mobilen Phase erlauben. Hier muss man die stationäre Phase zunächst mit reinem Methanol aktivieren, die Bürsten richten sich auf; bevor man auf das wässrige System umkonditioniert.

Falls die Qualität der Säule stark nachlässt, sollte man zunächst das Ergebnis mittels Testchromatogramm verifizieren und ggf. über Handlingsfehler nachdenken, bevor man die Säule reklamiert oder einfach austauscht.

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Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Hochleistungsflüssigkeitchromatographie (engl. high performance liquid chromatography, HPLC) - in den Anfangszeiten dieser Technik auch Hochdruckflüssigchromatographie (engl. high pressure liquid chromatography) genannt - ist eine analytische Methode in der Chemie. Die HPLC ist ein Flüssigchromatografie-Verfahren mit der man nicht nur Substanzen trennt, sondern diese auch über Standards identifizieren und quantifizieren (die genaue Konzentration bestimmen) kann. Weiterlesen auf Wikipedia.

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Bestimmung von Koffein in Kaffee mittels HPLC mit Direktinjektion

Koffein ist die wohl die am meisten verbreitetete Droge auf der Welt, die man sich problemlos selbst verabreichen kann. Dabei stimuliert es das zentrale Nervensystem und wird daher auch als schmerzhemmende Substanz in Präparaten z.B. gegen Kopfschmerzen und Migräne eingesetzt... Komplette Artikel als PDF.

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Geschichte der Chromatographie

Die Chromatografie ist eine erst ca. 150 Jahre alte Wissenschaft, obwohl der Begriff wesentlich älter ist, aber ursprünglich die Lehre der Farben und Pigmente umfasste. Als Entdecker der Chromatografie im heutigen Sinne kann mit Fug und Recht Friedrich Ferdinand Runge (1795 – 1867) genannt werden. Komplette Artikel als PDF.

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Entwicklung – mit oder ohne Kammersättigung?

Die Chromatogrammentwicklung in der Dünnschichtchromatographie verläuft häufig nicht reproduzierbar. Komplette Artikel als PDF.

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